图1 实验流程图

①顺利获得UPLC-MS/MS取得灵芝孢子粉的化学信息，并用质谱分子网络对数据进行快速解析；

②顺利获得中性粒细胞或巨噬细胞缺陷斑马鱼模型，以中性粒细胞数量、巨噬细胞数量及巨噬细胞吞噬活性三个方面来评价其免疫调节活性；

③根据灵芝孢子粉样品中各成分的峰面积及相应的药效，顺利获得偏最小二乘回归（PLSR）算法计算各成分的免疫活性并排序，筛选出潜在的免疫活性成分。

☀ 灵芝孢子粉（GLS）

☀ 破壁灵芝孢子粉（BGLS）

☀ 去壁灵芝孢子粉（RGLS）

图2 典型色谱图（A）；基于分子网络的灵芝三萜类成分快速解析图（B）

实验数据显示：

1、分别从灵芝孢子粉、破壁灵芝孢子粉和去壁灵芝孢子粉中鉴定出20、96、109种三萜类化合物。说明去壁之后三萜类化合物的种类也提高了。

2、以峰面积为指标，发现去壁灵芝孢子粉单个三萜化合物的含量比破壁灵芝孢子粉提高2倍以上，最高提高超16倍。

这说明去壁工艺可以富集灵芝孢子粉的有效成分，显著提高其含量。

构建斑马鱼中性粒细胞、巨噬细胞缺陷模型。

图3  破壁、去壁灵芝孢子粉对中性粒细胞及巨噬细胞减少症的药效作用

实验数据显示：

1、不同浓度的破壁和去壁灵芝孢子粉作用后，斑马鱼中性粒细胞数量有不同程度的恢复，其中33 μg/mL的去壁孢子粉可以极显著促进中性粒细胞的生成数量，效果也优于破壁孢子粉；

2、高浓度的去壁灵芝孢子粉（333、1000 μg/mL）可显著促进巨噬细胞的形成，并增强其吞噬功能，而破壁孢子粉的作用没有显著性。

这说明去壁灵芝孢子粉的作用要优于破壁灵芝孢子粉。

图4 基于偏最小二乘回归（PLSR）的灵芝孢子粉免疫活性成分分析

实验数据显示：

以上结果提示灵芝孢子粉的免疫调节活性与有效成分三萜含量呈正相关。本研究使用偏最小二乘回归（PLSR）来寻找化学成分（X变量）和活性（Y变量，即中性粒细胞回收率、巨噬细胞形成效率、巨噬细胞吞噬效率）之间的相关性。如图4所示，20-hydroxylganoderic acid G、elfvingic acid A、elfvingic C、lucidenic acid I、 ganohainanic acid C等11个成分得分较高，可能为潜在的免疫活性成分，应进一步采用体内和体外实验进行活性验证和机制研究。

本文是以下论文的解析版，如需原文请看：

Zhenhao Li ，Yingqiu Shi ，Xiaohui Zhang ，Jing Xu， Hanbo Wang ， Lu Zhao  and Yi Wang，《Screening Immunoactive Compounds of Ganoderma lucidum Spores by Mass Spectrometry Molecular Networking Combined With in vivo Zebrafish  Assays》，Frontier in Pharmacology，18 March 2020.